穩定同位素測定生物樣品：脫脂步驟不可省略及方法詳解

在穩定同位素（δ13C, δ15N）分析中，生物樣品前處理中的脫脂步驟絕對不可省略。脂質與蛋白質/碳水化合物的同位素分餾模式存在顯著差異：脂質富集12C，其δ13C值通常比組織主體低數‰（肌肉組織含脂量每增加1%，δ13C值可降低約0.2‰）；同時，脂質含氮量極低，高脂樣品會虛高δ15N值。忽略脫脂將引入嚴重偏差，導致生態食性、營養級推斷等結論錯誤。

以下介紹兩種常用、有效的脫脂方法：

1. 索氏提取法 (Soxhlet Extraction) - 經典可靠

* 原理： 利用溶劑持續回流循環萃取樣品中的脂質。

* 試劑： 常用氯仿-甲醇混合液（2:1, v/v, Folch法）或石油醚。氯仿-甲醇對磷脂、糖脂等極性脂質提取效率更高。

* 步驟： 將干燥、研磨后的樣品裝入濾紙筒，置于索氏提取器中。加入足量溶劑，加熱回流。溶劑蒸氣上升、冷凝后滴入樣品室，浸提脂質，當液面超過虹吸管高度時，富含脂質的溶劑回流至燒瓶。此循環持續數小時至24小時（取決于樣品量和脂含量）。

* 優點： 提取徹底、效率高、重現性好，尤其適合脂含量高或難提取的樣品（如骨骼、角質）。

* 缺點： 耗時長（通常6-24小時），溶劑消耗量大，需專用設備，且涉及易燃/有毒溶劑（需嚴格通風櫥操作）。

2. 超聲波輔助溶劑萃取法 (Ultrasonic-Assisted Solvent Extraction) - 快速高效

* 原理： 利用超聲波產生的強烈空化效應、機械振動和微擾流，加速溶劑分子滲透樣品基質并破壞細胞結構，促進脂質快速溶出。

* 試劑： 同索氏法（氯仿-甲醇混合液或石油醚）。

* 步驟： 將干燥、研磨后的樣品與適量溶劑加入離心管或玻璃瓶。將容器置于超聲波清洗儀（水浴式或探頭式）中，在設定溫度（常為室溫或低溫）下超聲處理。通常需多次短時超聲（如每次5-10分鐘，共2-4次），每次超聲間隔可短暫渦旋或搖勻。處理完畢后離心，棄去含脂上清液。重復萃取直至溶劑無色（通常2-3次）。最后徹底干燥脫脂樣品。

* 優點： 顯著縮短時間（通常15-60分鐘即可完成），溶劑用量相對較少，操作簡便。

* 缺點： 對非常致密或脂質結合緊密的樣品，效率可能略遜于索氏法。需注意超聲波可能產生熱量（需冰浴或使用冷卻型超聲儀），劇烈空化可能破壞樣品（對脆弱組織需優化參數）。同樣涉及易燃/有毒溶劑。

選擇與關鍵點：

* 索氏法適用于追求最高提取效率、處理大批量或難溶樣品。

* 超聲法適用于追求速度、處理常規組織（肌肉、肝臟、植物組織）樣品。

* 無論何種方法，脫脂后樣品必須徹底干燥（冷凍干燥或低溫烘干），避免殘留溶劑干擾后續元素分析儀（EA）燃燒。

* 所有操作必須在通風櫥內進行，佩戴防護裝備，妥善處理廢溶劑。

* 脫脂步驟必須在樣品研磨、干燥后進行，且同批次研究的所有樣品必須采用嚴格一致的脫脂方法以保證數據可比性。

省略脫脂步驟將直接污染同位素數據，導致生態學解讀失真。根據樣品特性與實驗室條件，合理選擇索氏法或超聲法并嚴格執行，是獲得可靠穩定同位素數據的關鍵前提。