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將少數菌落轉移到纖維素濾膜上

(1) 在含有選擇性的瓊脂平板上放一張纖維素濾膜。

(2) 用無菌牙簽將各個菌落先轉移至濾膜上,再轉移至含有選擇性但未放濾膜的瓊脂主平板上。應按一定的格子進行劃線接種(或打點)。每菌落應分別劃線于兩個平板的相同位置上。后,在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質粒的菌落。

(3) 倒置平板,于37℃培養至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。

(4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個以上的不對稱位置作標記。在主平板大致相同的位置上也作上標記。

(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應的結果。

(6) 裂解細菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結合于纖維素濾膜。

FISH是原位雜交技術大家族中的一員,因其所用探針被熒光物質標記(間接或直接)而得名,該方法在80年代末 被發明,現已從實驗室逐步進入臨床診斷領域。基本原理是熒光標記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火 溫度下復性;通過熒光顯微鏡觀察熒光信號可在不改變被分析對象(即維持其原位)的前提下對靶核酸進行分析。DNA熒光標記探針是其中常用的一類核酸探針。利用此探針可對組織、細胞或染色體中的DNA進行染色體及基因水平 的分析。熒光標記探針不對環境構成污染,靈敏度能得到保障,植物原位雜交技術服務,可進行多色觀察分析,因而可同時使用多個探針,縮 短因單個探針分開使用導致的周期過程和技術障礙。

分子病理學在蛋白質和核酸等生物大分子水平上,應用分子生物學理論、技術及方法研究疾病發生L發展的過程,從而為傳統的病理學注入了生機。在如今的臨床病理診斷過程中,運用核酸原位雜交、PCR技術、免1疫熒光、免1疫組織化學染色等技術,能夠更加深化對疾病的本質認識,對于腫1瘤的診斷和治1療也有著臨床的指導意義。分子病理學診斷主要應用于以下幾個方面:1、對于腫1瘤易感基因的檢測,對于腫1瘤高危人群的篩檢具有實用價值,如檢測GSTπ基因以判定個體暴露于致癌物是的致癌危險性。2、腫1瘤相關病毒的檢測,如采用原位雜交方法檢測標本中HPV、EBER等病毒。

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