LC-MS/MS小分子化合物分析參數設置指南LC-MS/MS是分析小分子化合物（、代謝物、環境污染物等）的技術。合理的參數設置是獲得高靈敏度、高選擇性和穩定數據的關鍵。以下是參數設置要點及案例：一、關鍵參數設置要點1.液相色譜(LC)部分:*流動相:/水或/水體系。通常提供更高靈敏度和更低背壓。添加揮發性緩沖鹽(如2-10mM甲酸銨、銨)或酸/堿(如0.1%甲酸、0.1%氨水)調節pH，優化化合物離子化效率及峰形。避免非揮發性鹽。*色譜柱:根據化合物極性選擇C18()、C8、HILIC等。粒徑(1.7-3.5μm)和柱長(50-150mm)影響分離度和速度。*流速:常用0.2-0.5mL/min(常規柱)或0.3-0.6mL/min(微徑柱)，平衡分離效率與質譜離子化效率。*柱溫:通常30-50°C，提高重現性并降低背壓。*進樣體積:根據濃度和柱容量優化，通常1-10μL。2.離子源(ESI或APCI):*離子化模式:ESI(適合極性和離子化化合物)或APCI(適合中等極性化合物)。*極性:根據目標化合物性質選擇正離子模式([M+H]?)或負離子模式([M-H]?)。*源溫度:常用300-600°C(ESI)，150-550°C(APCI)，促進溶劑揮發。*霧化氣/干燥氣流速:優化溶劑揮發效率，常用30-60L/h(ESI)，40-80L/h(APCI)。*毛細管電壓/電暈針電流:影響離子化效率，需優化(e.g.，ESI+3.0-5.0kV)。3.質譜(MS/MS)部分:*母離子選擇(Q1):選擇目標化合物的準分子離子([M+H]?，[M-H]?等)。*去簇電壓(DP)/碎裂電壓:優化去除溶劑加合物，獲得清晰母離子峰。*碰撞池(Q2):*碰撞氣(CAD):通常設為中等水平(4-8)。*碰撞能量(CE):關鍵參數之一！優化以產生豐度高、穩定的特征子離子。不同化合物、不同子離子所需CE差異大。*子離子選擇(Q3):選擇1-3個豐度高、特異性強的碎片離子作為定量/定性離子。*駐留時間(DwellTime):保證足夠數據點(>15點/峰)，通常10-100ms/離子通道。二、案例分析：水中甲惡唑(SMX)檢測*目標:檢測環境水樣中痕量甲惡唑。*儀器:UHPLC(WatersACQUITY)+TripleQuadMS(Sciex5500+)*LC條件:*色譜柱:AcquityUPLCBEHC18(1.7μm，2.1x50mm)*流動相:A:0.1%甲酸水溶液，B:0.1%甲酸溶液*梯度:0-1.0min(5%B)，1.0-3.0min(5%→95%B)，3.0-4.0min(95%B)，4.0-4.1min(95%→5%B)，4.1-5.5min(5%B)*流速:0.35mL/min*柱溫:40°C*進樣量:5μL*MS條件:*離子源:ESI+*離子源溫度:550°C*霧化氣(GS1):50psi，干燥氣(GS2):50psi，氣簾氣(CUR):30psi*離子噴霧電壓(IS):5500V*MS/MS參數(MRM):*母離子(Q1):m/z254.0([M+H]?)*去簇電壓(DP):80V*碰撞能量(CE):優化后為25eV*子離子(Q3):m/z156.0(定量離子)，m/z92.0(定性離子)*駐留時間:50ms/通道*結果:方法在0.1-50μg/L范圍內線性良好(R2>0.999)，檢出限(LOD)達0.03μg/L，回收率92-105%，精密度(RSD)提示:參數優化是迭代過程，需結合化合物性質、基質效應和儀器性能進行系統調整，尤其關注流動相添加劑、離子源參數和碰撞能量，確保方法穩定、靈敏、可靠。

一、定量法：外標法/內標法原理：通過建立目標分析物濃度與儀器響應值（峰面積/峰高）之間的標準曲線，計算未知樣品中該物質的含量。1.外標法(ExternalStandardMethod)*操作：配制一系列已知濃度的標準品溶液，在與待測樣品完全相同的色譜、質譜條件下進樣分析，lcms 分析多少錢一次，繪制標準曲線（濃度vs.響應值）。將待測樣品的響應值代入曲線方程計算濃度。*優點：操作簡單，成本低，無需特殊標記試劑。*缺點：*易受基質效應影響（樣品基體可能抑制或增強離子化效率）；*進樣誤差直接影響結果準確性；*對儀器穩定性要求高。*適用場景：基質簡單、通量高的小分子定量（如代謝物、環境污染物）。2.內標法(InternalStandardMethod，IS)*操作：在樣品和標準品中加入穩定同位素標記的內標物（如13C、1?N標記的同類化合物）。以內標物的響應值為參照，lcms 分析公司，計算目標物與內標的響應比值，再通過比值-濃度標準曲線定量。*優點：*顯著抵消基質效應和儀器波動的影響；*減少進樣誤差；*準確度高、重現性好。*缺點：同位素內標合成成本高，且需化學性質與目標物高度匹配。*適用場景：復雜基質（如血漿、組織）中的定量（如臨床檢測、生物標志物驗證）。---二、相對定量法：標記法vs.非標記法原理：比較不同樣品中同一目標物的相對豐度差異，適用于組學研究中大規模目標物的并行分析。1.標記法(如TMT/iTRAQ)*操作：對不同樣品中的蛋白質/多肽進行化學同位素標記（如TMT10/11-plex），標記后混合為單一樣品進行LC-MS/MS分析。通過報告離子（ReporterI）的強度比值計算不同樣品間同一肽段的相對含量。*優點：混合后上樣消除分析波動，多重樣本（16重）同時比較，定量精度高。*缺點：標記效率可能不均一，標記試劑增加成本，通量受標記重數限制。*適用場景：中通量蛋白質組學差異分析（如細胞處理組vs對照組）。2.非標記法(Label-FreeQuantification，lcms 分析價格，LFQ)*操作：各樣品獨立進行LC-MS/MS分析，阜陽lcms 分析，通過比較色譜峰面積或MS1/MS2譜圖計數（如MaxQuant，Skyline軟件）計算目標物在不同樣品中的相對豐度。需嚴格平行實驗和化處理（如總離子流校正）。*優點：樣本處理簡單靈活，成本低，無通量限制，適合大規模樣本。*缺點：對實驗重復性要求極高，色譜保留時間漂移影響比對，定量精度低于標記法。*適用場景：高通量蛋白質組/代謝組學篩查（如臨床隊列研究）。---關鍵步驟共通點兩種方法均需：1.色譜分離優化（減少共洗脫干擾）；2.質譜方法優化（選擇高特異性離子對，如MRM/SRM模式）；3.嚴格質量控制（標準曲線R2>0.99，QC樣品RSD4.數據規范化處理（消除系統誤差）。---總結：外標/內標法適用于定量，其中內標法抗干擾能力更強；標記法與非標記法則服務于大規模相對定量，分別在高精度與靈活性上各有優勢。方法選擇需結合實驗目的、樣本復雜度及成本綜合考量。

生物樣品LC-MS/MS檢測：不容忽視的樣品保存黃金法則生物樣品的穩定性是LC-MS/MS檢測成功的基石。忽視保存要點，可能導致目標物降解、轉化或基質效應加劇，直接影響數據的準確性與可靠性。以下關鍵環節務必嚴格把控：1.溫度控制：生命活動的“暫停鍵”*立即處理與預冷：采集后（尤其是血液、組織），立即置于冰上（4℃）或預冷的離心管/保存管中，抑制酶活性與化學降解。*速凍是關鍵：需長期保存（>24-48小時）的樣品（血漿/、組織勻漿、細胞裂解液、尿液等），必須快速冷凍。推薦使用液氮或干冰，避免冰晶緩慢形成破壞細胞結構或目標物（如蛋白質、多肽、不穩定的代謝物）。-80℃超低溫冰箱是長期保存的金標準。*避免反復凍融：凍融循環是樣品穩定性的大敵！每次凍融都可能導致目標物降解、蛋白質聚集或沉淀。務必分裝保存！將樣品預先分裝成單次檢測用量的小份，僅在使用時取出所需分量。標記清晰，避免混淆。2.防腐與穩定劑：抵御降解的“”*血液樣品：根據目標物性質選擇合適的抗凝劑（EDTA、肝素、檸檬酸鈉）。某些檢測需特定添加劑（如NaF抑制糖酵解酶保血糖穩定；蛋白酶混合物保護多肽/蛋白質）。*其他樣品：尿液、組織勻漿等也需考慮添加穩定劑（如酸、堿、劑、螯合劑），具體需參照分析方法或文獻。添加任何穩定劑前，務必確認其不影響后續LC-MS/MS分析（如不引入干擾峰、不抑制離子化）。3.避光與惰性環境：減少“意外”反應*避光：對光敏感的目標物（如某些維生素、膽紅素、光敏及其代謝物），保存和操作全程需使用棕色避光管或在暗處進行。*惰性氣體保護（可選）：對氧極度敏感的樣品（如某些多不飽和脂肪酸、還原性物質），可在樣品上方充入氮氣或氣以置換空氣，減少氧化反應。4.容器選擇與清潔：避免“額外貢獻”*材質：聚（PP）材質管。避免使用普通玻璃（易吸附、可能溶出離子）或含增塑劑的塑料管（如某些PVC管）。特殊檢測（如痕量金屬分析）需使用超潔凈管。*清潔度：確保容器無污染、無殘留。新管也可能含添加劑，必要時清洗。避免使用含洗滌劑殘留的容器，其可能嚴重干擾質譜信號。5.記錄與監控：可追溯的“生命線”*清晰標記：樣品信息（ID、類型、采集日期時間、保存條件、添加物、分裝次數、凍融次數）必須清晰、牢固標記。*溫度監控：冰箱/冰柜需配備持續溫度記錄儀并定期校準，確保實際溫度符合要求（-80℃冰箱實際溫度應在-70℃至-80℃間）。液氮罐需定期補充液氮。*凍融記錄：嚴格記錄每次取用（凍融）的時間和操作人。總結：生物樣品的保存絕非簡單的“放進冰箱”。它是貫穿從采樣到上機前整個流程的精密管理，目標是維持目標分析物的原始狀態與濃度。嚴格遵守溫度控制、合理使用穩定劑、避免物理化學應激（光、氧、凍融）、選擇合適容器并做好詳實記錄，是確保您的LC-MS/MS檢測結果準確、可靠、可重現的黃金法則。忽視任何一個環節，都可能讓寶貴的樣品和后續分析工作功虧一簣。